Полностью функциональное замещение утраченного зуба биоинженерным трансплантатом

Идея трансплантации зубов отнюдь не нова – в действительности, еще в древнем Египте рабов понуждали «отдавать» свои зубы фараонам. Однако проблема гистологической совместимости значительно снижала ценность подобной методики. А вот аутотрансплантация (то есть перемещение зуба данного конкретного человека из одной позиции в другую) в большинстве случаев работает достаточно хорошо. Например, у пациента с поврежденным моляром обнаруживается ретинированный или сверхкомплектный моляр – тогда поврежденный зуб можно удалить и успешно заменить на непрорезавшийся.

Но еще никому не удавалась успешная трансплантация зубного зачатка с его последующим развитием в полноценный работоспособный орган.

Значительного (можно сказать, сенсационного) прогресса в этой области добилась группа японских ученых под руководством профессора Takashi Tsuji (Tokyo University of Science). Метод опробован пока только на мышах, однако в будущем, по мнению ученых, он может быть применен и в стоматологической практике. Подробный отчет о результатах исследований опубликован в официальном журнале Национальной академии наук США.

Методика

• Конструирование зубного зачатка

В качестве исходного клеточного материала был взят зачаток моляра от эмбриона мыши (14,5 дней); проведена сепарация эпителиальных и мезенхимальных клеток. Затем, используя разработанный ранее 3-D метод клеточных манипуляций (так называемый organ germ method), был создан зачаток биоинженерного зуба (Fig. 1).

Fig. 1 Схематическое представление методики трансплантации, используемой для генерации зубного зачатка

Причём любопытно, что контролируя количество эпителиальных и мезенхимальных клеток в зачатке, можно получать различные зубные структуры. Так, в предыдущих экспериментах соотношение 5×10⁴ эпителиальных и 1×10⁵ мезенхимальных клеток давало в итоге множественный зуб. А в настоящем исследовании удалось стабилизировать условия для выращивания единичной зубной структуры (single bioengineered molar) – по 5×10⁴ клеток.

Инкубационный период in vitro составил 5 дней при 37 °C в специальной культуре, в результате был получен биоинженерный зубной зачаток размером около половины миллиметра (Fig. 2).

Fig. 2 Фазо-контрастный снимок зубного зачатка, пятый день инкубации

• Трансплантация зубного зачатка

Трансплантационной моделью в текущем исследовании являлась область альвеолярного отростка челюстной кости взрослой особи мыши после удаления верхнего первого моляра (Fig. 3).

Fig. 3 Гистологический анализ первого моляра взрослой мыши (слева) и верхней челюсти после его экстракции и залечивания раны в течении 3-х недель (справа) посредством гематоксилин-эозин окрашивания (ГЭ)

С помощью микрохирургических инструментов в костной альвеоле формировалось ложе надлежащего размера, куда и пересаживался зубной зачаток – эксплант (explant) – с соблюдением правильной ориентации (Fig. 1, 4, 5).

Fig. 4 Внутриротовые снимки биоинженерного зуба: a – перед прорезыванием; b – непосредственно после прорезывания; c – полная окклюзия
Fig. 5 Гистологический анализ биоинженерного зуба в процессе прорезывания и окклюзии

Прорезывание и окклюзия

• Появление бугорка биоинженерного зуба в ротовой полости происходило на 36.7 ± 5.5 день после трансплантации. Вертикальные размеры коронки постоянно увеличивались, и уже на 49.2 ± 5.5 день зуб-эксплант достигал плоскости окклюзионного контакта с антагонистом (нижним первым моляром) (Fig. 6, 7).

Fig. 6 Внутриротовые снимки биоинженерного зуба перед прорезыванием (слева), непосредственно после прорезывания (в центре) и в полной окклюзии (справа): A – под углом в 45° и окклюзионно; B – щечно при смыкании

Fig. 7 Компьютерная томография: A – микро-КТ снимки биоинженерного зуба в процессе прорезывания и окклюзии (внешняя поверхность и поперечные срезы); B – исследование черепно-лицевой области мыши с регенерированным зубом

• Процесс остеогенеза (восстановления костной ткани в области пересадки) проистекал согласованно с развитием корневых структур биоинженерного зуба, так что у экспланта имелось достаточно периодонтального пространства для роста (Fig. 5, 7).

• Строение и свойства новых (регенерированных) зубов, как показали ученые в своей публикации, ни чем не отличаются от нормальных, за исключением небольших отклонений в геометрии коронки:

1. сформирована правильная структура, состоящая из эмали, амелобластов, дентина, одонтобластов, пульпы, альвеолярной кости, кровеносных сосудов;
2. корень окружен адекватными периодонтальными связками (ПДС);
3. морфологически коронка зуба имеет сложное многобугорковое строение, однако несколько меньший размер, поскольку в настоящий момент, используя метод клеточных манипуляций in vitro, регулировать ширину коронки и положение бугров и бороздок друг относительно друга не представляется возможным.

• Для дифференциации клеток регенерированного зуба применялась методика трансплантации GFP-модифицированного зубного зачатка. GFP (green fluorescence protein) – зеленый флюоресцентный белок – позволяет видеть, куда именно мигрировали клетки экспланта, и отслеживать процесс интеграции новых тканей.
GFP-зубной зачаток конструировался из нормальных эпителиальных клеток и мезенхимальных клеток GFP-трансгенной мыши; был пересажен нетрансгенной особи и своевременно развился в полноценный зуб (Fig. 8).

Fig. 8 Снимок GFP-биоинженерного зуба в ротовой полости взрослой особи мыши	Fig. 9 Флюоресцентный снимок GFP-зуба в сечении

GFP-позитивные мезенхимальные клетки также обнаружены в одонтобластах, пульпе, ПДС и дифференцируются от папиллярных и фолликулярных клеток, соответственно. Эффект флюоресценции наблюдается и в дентинных канальцах (tubules) GFP-позитивных одонтобластов биоинженерного зуба (Fig. 9).

• Окклюзионный контакт с нижним зубом-антагонистом физиологичен: поддерживаются правильные вертикальные соотношения между взаимодействующими буграми и бороздками; не происходит избыточного роста коронки или перфорации верхнечелюстного синуса (Fig. 10, 11).

Fig. 10, 11 Интраоральный и микро-КТ снимки окклюзионных взаимодействий нормального и биоинженерного зубов

Жевательная функция

Способность выдерживать жевательные нагрузки является важнейшим показателем функциональности зубов. Для определения прочностных характеристик как эмали, так и дентина биоинженерного зуба были проведены измерительные тесты с использованием специального прибора (Miniload Hardness Tester, Mitutoyo).

Fig. 12 Оценка прочности. Образцы эмали и дентина биоинженерного зуба (11 недель после трансплантации) сравнивались с аналогичными образцами нормального зуба (3 и 9 недель)

Результаты экспериментов свидетельствуют, что по устойчивости к нагрузкам регенерированный зуб не уступает собственным зубам мыши и способен выполнять полноценную жевательную функцию.

Реакция на механический стресс

Полноценный восстановленный зуб должен функционировать согласованно и в кооперации с окружающими тканями ротовой полости и челюстно-лицевого региона в целом через систему периодонтальных связок. Гистологический анализ ПДС биоинженерного зуба (Fig. 5) демонстрирует позитивную связь этого зуба с альвеолярным отростком и дает основания полагать, что данный зуб может реагировать на механический стресс так же как и в гармонии с собственными зубами животного-реципиента.

В настоящем исследовании в качестве фактора механического стресса выступает экспериментальное ортодонтическое лечение, при котором никель-титановая дуга диаметром 0.012 дюймов (VIM-NT, Oralcare Co.) использовалась для перемещения зубов в буккальном направлении (Fig. 13).

Fig. 13 Гистологический анализ (ГЭ окрашивание) поперечных срезов корня нормального и биоинженерного зубов на 0 (слева), 6 (в центре) и 17 (справа) день экспериментального движения зубов

Удалось индуцировать и проанализировать ремоделирование костной альвеолы как ответ ПДС на движение зубов (Fig. 14 a-b). Локализация остеокластов, резорбирующих костную ткань, и остеобластов, необходимых для ее формирования, наблюдалась в областях сжатия и растяжения, соответственно (Fig. 14, 15).

Fig. 14 Гистологический анализ (ГЭ окрашивание) поперечных срезов корня нормального (a) и биоинженерного зубов (b) при экспериментальном ортодонтическом лечении. Области растяжения (T) и сжатия (C) в ПДС показаны с большим увеличением по центру и снизу, соответственно

Fig. 15 Анализ корня биоинженерного зуба на формирование кости с помощью fluorescent double-labeling experiment. При большем увеличении показана область растяжения с меченными остеобластами

Полученные результаты подтверждают, что ПДС биоинженерного зуба способствует успешной перестройке костной ткани посредством правильной локализации остеокластов и остеобластов при реакции на механический стресс.

Чувствительность нервных тканей

Способность воспринимать болевые импульсы и передавать информацию в центральную нервную систему является ключевым фактором в защите организма от неблагоприятных воздействий внешней среды. Ранее этой группой ученых было показано, что внутри экспланта формируется нервная ткань, а в ПДС восстанавливается сосудисто-нервный пучок. В текущем же исследовании оценивалась реактивность нервных волокон пульпы и ПДС по отношению к внешним раздражителям.

Для проверки уровня болевой чувствительности биоинженерного зуба и определения путей передачи нервных импульсов использовалась холодовая стимуляция обнаженной пульпы (Fig. 16). Методика заключалась с следующем. Пульпарная камера зуба (регенерированного или контрольного нормального первого моляра) вскрывалась с помощью стоматологической установки (Shofu Inc.), укомплектованной алмазными борами, под глубокой анестезией. Для стимумяции пульпы к полученной полости прикладывался лед. Серия экспериментов доказала, что при воздействии на зуб мышь чувствует боль, а уровень чувствительности биоинженерного зуба и способность к предаче сигналов соответствует естественному.

Fig. 16 Болевая чувствительность. Иммуногистохимический анализ нервных волокон в пульпе и ПДС нормального и биоинженерного зуба с использованием специфичных антител

Эти данные показывают, что волокна, иннервирующие пульпу и ПДС биоинженерного зуба, имеют адекватный персептивный потенциал к болевым воздействиям и могут передавать информацию в ЦНС (medullary dorsal horn).

Заключение

И, хотя предстоит решить еще некоторые проблемы – научиться контролировать морфологию, общий размер, скорость роста зубов, – успех эксперимента открывает новые возможности в области репродуктивной медицины, поскольку технология применима и к человеку.

Как говорят исследователи, их работа обеспечивает если не получение новых зубов в стоматологических клиниках, то как минимум лабораторную модель для дальнейших поисков методики. Кроме того, прогресс в области регенеративной медицины позволяет надеяться, что в будущем станет возможным выращивать не только зубы.

«Конечная цель всех исследований в области регенеративной медицины – создание полностью развитых правильно работающих биоинженерных органов, которые заменят испорченные травмой, болезнью или старением», – поясняет Takashi Tsuji.